分子生物学

（1）引物设计与合成

qPCR实验中，引物设计也是非常重要的一个环节，引物的合适与否与扩增效率是否达标、扩增产物是否特异、实验结果是否可用等息息相关。设计qPCR引物时，通常要留意以下几点：引物尽量要跨内含子设计、产物长度100~300 bp、Tm值尽量接近60℃且上下游引物尽量接近、引物末端最好是G或C等等。

1. 引物跨内含子设计

在设计qPCR引物时，选择跨内含子设计的引物可以使gDNA模板不能得到扩增，产物均来源于cDNA的扩增，这样也就去除了gDNA污染造成的影响。

2. 引物长度

引物长度一般在18~30 nt之间，扩增产物长度尽量控制在 100~300 bp之间。

引物设计太短会导致非特异扩增，太长则容易形成二级结构(如发夹结构)。扩增产物太长不适于聚合酶进行反应，会影响到PCR扩增效率。

3. GC含量和Tm值

引物GC含量控制在40%~60%之间，过高或过低都不利于引发反应。正反向引物GC含量应接近相同，以便获得相同的 Tm值和退火温度。

Tm值应尽量在55~65℃之间，一般为60℃左右，上下游的Tm值应尽量姐接近，最好不超过4℃。

4. 引物3′端末端避免选择A

引物3′端错配时，不同碱基引发合成效率存在着很大的差异，当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链合成，而当末位为T时，错配引发效率大大降低。因此引物3′端尽量避免选择A，最好选择T。

若为探针引物，则探针5′端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。

5. 碱基分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的，3′端避免超过3个连续的G或C，3个以上连续的G或C容易在GC富集序列区产生配对。

6. 引物设计区域应避开复杂二级结构。

扩增产物单链形成二级结构会影响PCR顺利进行，可通过提前预测靶序列是否存在二级结构，尽量避开该区域设计引物。

7. 引物自身和引物之间应尽量避免碱基连续互补。

引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠形成发夹结构，而影响引物与模板的复性结合。

上下游引物之间也不能存在互补序列，引物之间互补会产生引物二聚体而降低PCR效率甚至影响定量准确性。如果引物二聚体及发夹结构不可避免，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5 kcal/mol）。

8. 引物扩增的是目标特异产物。

qPCR检测最终目的是了解目的基因的丰度，如果出现非特异扩增，定量会不准确。所以设计好引物后，需要对其进行BLAST检测，在序列数据库中比对产物的特异性。
 

（2）核酸提取/纯化

核酸是一类具有复杂结构和重要生物功能的生物大分子，主要由核苷酸单元组成。核苷酸是由磷酸基团、五碳糖和一种氮碱基组成的分子。这些核苷酸单元通过磷酸二酯键连接在一起，形成长链，构成核酸的基本结构。在生物体中，核酸主要承担着存储和传递遗传信息的重要角色，对生物体的生长、发育和功能发挥至关重要。抽提样本中的DNA、RNA，为下游实验提供高纯度和高浓度的模板。

DNA样本采集与保存的注意事项：

1 新鲜：新鲜样本中受到内源性核酸酶影响相对最小，得到DNA质量相对更好。

2 适量：投入过多样本，后续样本裂解不充分从而影响DNA提取情况，还会引入过多杂质及内源性核酸酶。3 不同类型的样本在采集与保存时会存在差异：

①动物组织保存时间：-20℃短期保存（1-3个月），-70℃长期保存；

②福尔马林固定时间8-24h内为宜，样本存放时间不宜超过1年；FFPE样本保存温度4℃，建议不超过3年。

③血液（全血）：可使用不同抗凝剂的抗凝管进行采集和保存；避免反复冻融，4℃短期保存3-4天，-20℃下可最多保存2年，全血、白细胞、血凝块、血清或血浆-70℃下长期保存。

RNA样本采集与保存的注意事项：

RNA稳定性差，极易降解，主要是由于内源性核酸酶（ribonucleaseRNAase）的作用，

a.固体组织样本的储存温度：长期储存的新鲜冰冻组织和 OCT包埋冰冻组织应储存于液氮中，冰冻组织切片或者用于DNA和RNA提取的冰冻组织应储存在-80℃。经过福尔马林固定的石蜡包埋组织及组织切片应储存在室温，在低于 27℃的环境下，并控制虫患和湿度。

b.液体样本的储存温度：对于液体样本，包括血液和尿液，样本里的各种成分应在储存前分离，使得每一种成分能够在最佳条件下储存。全血、血清、血凝块、非淋巴细胞和血浆样本应储存在-80℃。血沉棕黄层和白细胞应储存在液氮中。尿液应储存在-80℃或者液氮中。

c.细胞的储存温度：长期保存的细胞系应储存在液氮中。气相液氮比液相液氮储存样本更好。虽然液相液氮的温度更低一些（-196℃），但气相液氮的温度（-150℃）仍在临界温度之下。对于需要但没有条件使用液氮保存的细胞样本，应至少储存-80℃环境中。

 

（3）逆转录

逆转录（reverse transcription），是以RNA为模板合成DNA的过程，合成的DNA称为cDNA。逆转录过程遗传信息的流动方向为RNA到DNA，与转录过程DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录，
RNA容易降解不易保存，为了方便后续的实验与鉴定，酶促催化使RNA反转录为cDNA第一链。一条寡聚脱氧核苷酸引物先与RNA杂交，然后由RNA依赖的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。依据实验的不同目的，针对cDNA第一链合成的引物可根据特殊的靶基因设计，或可用随机引物与所有mRNA杂交。

 

（4）PCR/RT-qPCR

PCR（聚合酶链式反应）是一种在体外快速、大量复制特定DNA片段的技术，其基本原理模拟了细胞内的DNA半保留复制过程。

DNA复制时，以亲代DNA的两条链分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，组成新的DNA分子，新形成的两个子代DNA与亲代DNA的碱基顺序完全一样。

PCR扩增原理主要为：①变性：PCR循环开始时，将含有模板DNA的反应体系加热至90-96℃（通常为94℃），使DNA双螺旋结构解旋成两条单链，以便后续引物结合。②退火：降温至45-65℃（典型值为50-60℃或针对特定引物优化的温度），在这个阶段，设计好的一对寡核苷酸引物与模板DNA单链上的互补序列结合。③延伸：在72-75℃条件下（通常为72℃），热稳定DNA聚合酶（如Taq酶）从引物的3'端开始合成新的DNA互补链，沿模板方向进行延伸，生成新的双链DNA分子。

通过电泳检测扩增效果，并确认条带大小与预期目标一致，必要时可通过测序验证PCR产物的准确性。

RT-qPCR是指定量反转录聚合酶链反应，这里“RT”不是“实时”。与使用DNA模板的qPCR不同，RT-qPCR的起始材料是RNA，因此，在正常的qPCR扩增过程开始之前，实验中包含一个逆转录步骤，将RNA转换成cDNA。在基于染料的qPCR中，使用一种嵌入染料，在未结合时显示微弱的荧光，当与dsDNA结合时增加到强荧光信号。SYBR® Green是最常用的dsDNA结合染料之一。荧光与存在的dsDNA数量成正比，能够计算出原始模板数量，PCR过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数为Ct值，分析定量时目的基因Ct值取15-35较好，内参基因的Ct值一般在13-15左右较好。
最后根据实验结果判断Ct值、溶解曲线和扩增曲线等判断数据是否可用，最后根据Ct值计算出样本的表达水平差异倍数，再根据数据进行图形绘制。

 

（5）质粒提取/转染

基因研究中常需要通过上调靶基因的表达来观察表型变化。过表达 (Over-Expression，OE) 是上调基因表达最常用的方法，其基本原理是将目的基因构建到质粒或病毒载体中，导入细胞内使基因的表达量增加。

使用质粒法过表达外源基因具有简便、成本低和实验体系成熟等优点，因此大多数实验室会偏向于使用质粒法。

首先需要构建质粒，转化，扩增，提取及鉴定。质粒的构建可经公司购买得到，一般同时提供阴性对照菌液及质粒。

构建质粒：利用限制性内切酶消化获得线性化载体，PCR 扩增制备目的基因片段，所用扩增引物需在其 5' 端添加同源重组序列，使用该引物扩增基因片段，扩增产物 5' 和 3' 最末端的序列分别与线性化载体两末端序列完全一致。以线性化载体和基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现体外环化。

转化扩增：在感受态细胞中转化，并在含有抗性的固体培养基培养，挑取单菌落扩菌培养。

质粒抽提鉴定：扩增结束后可按照质粒抽提试剂盒对质粒进行提取。质粒提取的目的是去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA 分开，随后去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。按得到质粒 DNA 的量可将质粒抽提方法和试剂盒分为小提，中提，大提。小提简便、快速，DNA获得量在100-200ng/mL，适用于常规的载体构建；中提在小提基础上进一步去除了菌液内毒素，DNA获得量在0.7-1 μg/mL，适用于酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、细胞转染等；大提纯化要求更高，使用配套纯化柱，DNA获得量在0.5-2 μg/mL，适用于慢病毒、腺相关病毒包装，多数细胞转染或其他需要大量质粒的实验。

提取的目的基因过表达质粒和阴性对照质粒，进行测序 。将测序结果与目的基因序列进行比对分析，后续进行质粒转染。
 

（6）慢病毒转染

慢病毒转染是一种常用的基因转导技术，它能够高效地将外源基因整合到宿主细胞的基因组中，通常不激活宿主细胞的免疫应答，这有助于维持长期稳定的基因表达，并且减少了宿主对转染的排斥。

MOI（Multiplicity of Infection），即感染复数，是慢病毒转染中一个重要的参数，它指的是在转染过程中病毒颗粒的数量与宿主细胞数量的比值。MOI值的高低直接影响了病毒的感染效率和细胞的存活率。在正式实验前，需要进行预实验以确定最佳的MOI值，以达到理想的实验效果。MOI值的设置通常从低到高，具体值需要根据目标细胞对病毒的敏感性、病毒载体的荧光强度以及实验目的来确定。一般来说，较高的MOI值可以增加病毒感染的可能性，但同时也可能增加对细胞的毒性。可以通过设置不同的MOI梯度，观察细胞状态和荧光情况，来确定较适宜的MOI值。细胞的良好生长状态是达到高感染效率的保证，因此在感染时需要确保细胞处于健康状态。不同细胞系和不同类型的病毒载体可能需要不同的MOI值，因此在没有文献参考的情况下，建议首先设置较大梯度的MOI进行预实验。

转染主要包括以下步骤：

①目标细胞的准备：

铺细胞：将目标细胞种植在适当的培养容器中，使其达到50-70%的融合度。

细胞状态：确保细胞处于健康状态，没有污染。

②感染过程：

调整病毒浓度：根据MOI值计算所需的病毒体积，并用适当的培养基稀释。

添加病毒：将稀释后的病毒液添加到目标细胞中，轻轻摇匀。

辅助感染：为了提高感染效率，可以添加辅助感染试剂，如Polybrene。

③感染后处理：

培养：将细胞在含有病毒的培养基中培养一定时间（通常为4-6小时）。

更换培养基：去除含病毒的培养基，更换为新鲜完全培养基。

④感染效率的评估：

观察：使用显微镜观察细胞状态，如果载体带有荧光标记，可以通过荧光显微镜评估感染效率。

抗性筛选：如果慢病毒载体携带有筛选标记基因（如抗生素抗性基因），可以在感染后48-72小时通过加入相应的筛选剂（如Puromycin）来筛选出稳定表达外源基因的细胞株

⑤筛选稳定表达的细胞株：

根据筛选标记选择合适的筛选剂浓度，进行细胞筛选。

筛选后的细胞需要扩增并进行进一步的表型和基因型分析。
 

（7）核酸分子杂交

核酸分子杂交是一种基于核酸分子碱基互补配对原则的技术，用于检测和分析DNA或RNA分子之间的相互作用和相似性。这项技术在基因组学、分子生物学和医学研究中有着广泛的应用。

核酸分子杂交的基本原理是核酸双链之间的互补配对，即碱基对配对（A-T和G-C）。当一条单链DNA或RNA探针与其互补的靶序列接触时，探针会与靶序列杂交形成双链结构。这种杂交可以在液相（如溶液中）或固相（如膜上）进行。

主要步骤包括：

①制备探针：选择合适的探针序列，通常是与靶序列互补的一段核酸序列。探针可以通过化学合成或酶促反应制备，并进行标记（如放射性标记或荧光标记）。

②样品处理：根据实验类型处理样品，例如DNA或RNA的提取和电泳分离，或组织切片的制备。

③杂交反应：将探针与样品一起孵育，使探针与靶序列结合。杂交条件（如温度和盐浓度）需优化以保证特异性和灵敏度。

④检测和分析：根据探针的标记方式，利用相应的检测方法（如放射自显影或荧光显微镜）检测探针与靶序列的结合情况，并进行定量或定性分析。

应用：

基因检测：通过分子杂交技术，可以检测基因组中的特定基因突变或变异，应用于遗传病的诊断和研究。

基因表达分析：通过Northern杂交，可以分析特定基因在不同组织或细胞中的表达水平，帮助理解基因功能和调控机制。

基因定位：荧光原位杂交（FISH）技术可以精确定位基因在染色体上的位置，应用于染色体结构异常的检测和基因组图谱绘制。

病原体检测：通过检测病原体特异的核酸序列，分子杂交技术可以快速准确地识别感染性病原体。