组织病理学

（1）脱钙与软化

组织脱钙与软化是病理学中常用的技术，特别是在处理含有钙盐的骨、牙齿及钙化组织时。这些组织由于其硬质特性，如果不进行脱钙处理，就无法进行常规的切片操作。脱钙的目的是使用化学或物理方法去除组织内的磷酸钙和碳酸钙，使组织软化，便于切片和后续的染色处理。

脱钙的方法：

①硝酸脱钙：这是一种快速脱钙方法，通常用于HE染色，形态保持良好，但对抗原的破坏较严重，不适用于组织化学分析。硝酸脱钙液的配方包括硝酸、冰醋酸、甲酸、水和甲醛。

②EDTA脱钙：EDTA（乙二胺四乙酸）是一种有机螯合剂，能够与钙离子结合，从而实现脱钙。这种方法对抗原保存较好，适用于免疫组化、荧光等后续检测，但脱钙时间较长，需要数天至数周。

③盐酸脱钙：盐酸脱钙速度中等，脱钙时间容易控制且不容易过度，因此在日常工作中最为常用。

④甲酸脱钙：甲酸也是一种常用的脱钙剂，适合骨髓组织脱钙，但不适合皮质骨的脱钙

选择合适的脱钙方法和处理时间对于保证组织结构的完整性和后续实验的成功至关重要。不同的脱钙方法有不同的优缺点，需要根据具体的实验需求和时间限制来选择最合适的方法。

 

（2）组织固定/脱水

组织固定、脱水、透明是病理学中制备组织切片的重要步骤，它们对于保持组织结构的完整性和进行后续的染色分析至关重要。

组织固定：固定的目的在于保存组织，防止组织的自溶改变，保留抗原性，并提高组织成分的折射率。

常用的固定液包括10%中性福尔马林（甲醛溶液），它对大多数病理标本都具有良好的固定作用，穿透速度快，组织硬化程度小。小标本一般固定4-6小时，大标本则需要18-24小时。固定液在24小时内不能穿透厚度大于2-3mm的实体组织，因此需要及时规范剖开标本，确保重要检查部位得到适当的固定。固定液的量一般应为被固定标本体积的5-10倍，以确保组织完全浸泡。

组织脱水：组织脱水的目的是将组织中的水分替换成石蜡，因为水和石蜡不相溶，但水可以被乙醇吸收，乙醇又能与二甲苯和石蜡相溶，所以通常使用乙醇和二甲苯作为脱水和透明的媒介。组织通常按照从低到高的浓度梯度进行乙醇脱水，然后经过二甲苯透明，最后浸入石蜡中。

需要注意的是：脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中的水分导致浓度降低，从而影响脱水效果。脱水时间需要根据组织的大小和性质进行调整，通常各级乙醇中放置45分钟到1小时。过度脱水会导致组织变硬，不利于后续的切片。脱水不彻底会导致透明时无法置换组织中水分，影响后续的浸蜡和切片质量。组织在高浓度乙醇中停留时间过长可能会导致组织过硬、扭曲，影响切片。

透明：透明化的目的是将组织内的脱水剂（通常是酒精）替换为能与石蜡相溶的溶剂，从而使石蜡能够顺利浸入组织中。这一步骤对于后续的石蜡包埋和切片至关重要。组织块先经过含有部分酒精和部分透明剂的混合液处理，以减少由于直接从酒精过渡到透明剂可能引起的组织收缩。例如，可以先使用50%酒精混合50%二甲苯的溶液。随后，组织块被转移到纯透明剂中进行处理。二甲苯是常用的透明剂，它能够迅速渗透组织，使组织变得透明。处理时间根据组织的大小和类型而定，通常在30分钟至2小时之间。在纯二甲苯中通常需要更换2次，总时间不超过3小时，以避免组织过度硬化和变脆。

 

（3）石蜡包埋/OCT包埋

组织包埋是病理学中制备组织切片的重要步骤，它涉及将组织固定、脱水、透明化后，浸入熔融的石蜡中，形成坚硬的蜡块，以便于后续的切片操作。石蜡包埋是将浸蜡的组织块放入包埋框中，倒入熔融的石蜡，待石蜡凝固后取出蜡块。OCT是将组织浸入冷却的OCT包埋剂中，确保没有气泡，然后在干冰上快速冷冻，储存于-80℃。

OCT包埋的优点在于它是一种水溶性的包埋剂，不会影响抗原的检测，适合于需要进行免疫组化等后续分析的组织样本。而石蜡包埋则适用于需要长期保存和进行HE染色等常规病理分析的组织样本。
 

（4）石蜡切片/冰冻切片

将已包埋好的蜡块切成小块，每一小块包含一块材料。然后按照所需的切面，用单面刀片将小蜡块切成梯形，并可粗视到材料切面。然后用烧红的蜡铲把蜡块底部牢固的粘接在载蜡器上。用切片机（如旋转切片机）将蜡块切成连续的蜡带。切片时先把切片刀夹在刀架上，再把载蜡器夹在固定装置上（注意安装切刀的角度，刀口运行方向与材料切面平行），然后调整好所需厚度，一般可在7~14微米，视材料和所需观察对象而定，转动切片机切片。切下来的切片经过镜检（根据情况也可不检），将符合要求的切片粘在洁净的载玻片上。粘片时先在载玻片上滴上几滴蒸馏水，然后用镊子小心把切片放在水上，在35-40℃下，用拨针将切片伸直、展平，倾斜载片，使水流去并烘干。粘片后要经过脱蜡、染色、再次脱水透明，然后封片永久保存。

冰冻切片取新鲜冷冻的材料，在样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10分钟让OCT胶浸透组织。取下组织置于锡箔或玻片上，再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架上30分钟。使用恒温冰冻切片机，低温室内温度以-15℃至-20℃为宜，进行切片。切片时，抗卷板的位置及角度要适当，切好后，室温放置30分钟，然后入4℃丙酮固定5-10分钟，烘箱干燥20分钟。

进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。冰冻切片技术因其快速、简便的特点，在病理学诊断、免疫组化研究、组织化学分析和神经科学研究等领域有广泛应用。

 

（5）苏木精-伊红染色（HE）

HE染色（Hematoxylin-Eosin staining），即苏木精-伊红染色，是病理组织切片中最常用的染色技术。它通过使用苏木精和伊红这两种染液，清晰地显示出组织结构和细胞类型。以下是HE染色的基本原理和步骤：苏木精是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。

步骤：

脱蜡：使用二甲苯去除切片中的石蜡。→水化：通过逐级酒精溶液使切片水化。→核染：使用苏木精染液对切片进行染色，使细胞核染成蓝色。→分化：使用盐酸酒精溶液进行分化，去除多余的苏木精染料。→复染：使用伊红染液对切片进行染色，使细胞质染成红色。→脱水：通过逐级酒精溶液去除水分。→透明：使用二甲苯使切片透明。→将透明化的切片滴加中性树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标签，切片标本即可使用。

通过HE染色，可以在显微镜下清晰地观察到组织结构、组织类型、细胞层次等，对于病理诊断和研究具有重要意义。
 

（6）TUNEL染色

TUNEL染色（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated dUTP Nick End Labeling）是一种用于检测细胞凋亡中DNA片段化的常用技术。其基本原理是在细胞凋亡过程中，DNA会在核小体间发生断裂，形成大量的双链或单链DNA缺口，这些断裂的DNA链会产生大量的3'-OH末端。TUNEL染色通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将带有荧光标记的dUTP连接到DNA的断裂处，从而在显微镜下观察到凋亡细胞的特征性染色，实现对细胞凋亡的定性和定量分析。

TUNEL染色的关键步骤包括：

固定：使用适当的固定液（如4%多聚甲醛）固定细胞或组织，以保持细胞形态和DNA结构的完整性。

通透：使用蛋白酶K等通透剂处理细胞或组织，以增加细胞膜通透性，使TUNEL反应混合物能够进入细胞内部。

TUNEL反应：在37℃下孵育，TdT酶将荧光标记的dUTP添加到DNA的3'-OH末端。

洗涤：用PBS洗涤以去除未结合的试剂，减少背景噪音。

检测：使用荧光显微镜观察荧光信号，或使用光学显微镜观察DAB等显色底物产生的染色。

TUNEL染色技术因其高灵敏度和特异性，在检测细胞凋亡方面得到了广泛应用。然而，它并不能区分凋亡和其他形式的细胞死亡，如坏死，因此在使用TUNEL染色时，可能需要结合其他方法来确定细胞死亡的类型。
 

（7）Masson染色

Masson染色（也称为马松染色）是一种用于显示组织中纤维的染色方法，特别适用于观察胶原纤维和肌纤维。Masson染色的原理基于阴离子染料分子的大小与组织的渗透性之间的关系。小分子量的染料可以穿透结构致密、渗透性低的组织，而大分子量的染料则只能进入结构疏松、渗透性高的组织。在Masson染色中，肌纤维间隙较小，小分子染料如丽春红可以渗透其中并染色，使其呈现红色；而胶原纤维间隙较大，大分子量的染料如苯胺蓝可以进入并染色，使其呈现蓝色或绿色。

染色步骤：

脱蜡至水：石蜡切片经过二甲苯和逐级酒精处理，最后用自来水冲洗。

苏木精染核：使用Regaud苏木精染液或Weigert铁苏木素染色液对细胞核进行染色。

盐酸酒精分化：使用1%盐酸酒精进行分化，然后充分水洗。

丽春红酸性复红液染色：使用Masson丽春红酸性复红液对肌纤维进行染色。

冰醋酸水溶液洗：使用2%冰醋酸水溶液进行短时间洗涤。

磷钼酸水溶液分化：使用1%磷钼酸水溶液对丽春红、酸性复红进行分化。

苯胺蓝或光绿液染色：使用苯胺蓝水溶液或1%光绿水溶液对胶原纤维进行染色。

脱水、透明、封片：最后通过酒精脱水、二甲苯透明化，然后用中性树胶封固。

最后染色结果，胶原纤维或蛋白、粘液、软骨呈蓝色（如果使用光绿液则呈绿色），胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质和红细胞呈红色，胞核呈蓝紫色。

 

（8）切片扫描

切片扫描技术通常涉及以下几个步骤：

①使用全自动显微镜扫描平台对玻璃切片进行扫描。

②通过专业摄像头捕捉图像，并通过控制软件进行图像的采集、处理和存储。

③扫描得到的数字图像可以进行无缝拼接，生成包含所有组织信息的全视野图像，即全切片图像（WSI）。

切片扫描的优势：

自动化处理：单次可加载多张切片，并可不停机连续追加，提高扫描效率 。

高分辨率成像：系统通常具备真实双物镜电动转换，提供超高分辨率和清晰度的图像 。

一体化景深扩展扫描：对于组织切片不平整的情况，可以进行多层扫描后融合，提高图像质量 。

信息永久保存：数字切片可以永久保存，便于传输和交流，解决了传统切片易损坏和难以长期保存的问题 。

远程会诊：通过数字化切片，可以实现远程病理诊断和学术交流，提高诊断的准确性和效率 。

切片扫描技术的发展，不仅提高了病理诊断的效率和准确性，也为病理学的教学和科研提供了新的工具和方法。随着技术的不断进步，未来数字病理将在更多领域发挥重要作用。