广州锐格生物科技有限公司

首页

基因编辑

CRISPR-Cas 系统最早在大肠埃希菌中发现。其功能是用来抵御噬菌体的感染，捕获来源于噬菌体的间隔序列整合到自身基因组中，以获得外源抵抗力。CRISPR-Cas 系统能使基因组免于噬菌体、病毒等的破坏与宿主 Cas 蛋白的获取抗噬菌体能力有关。

所属分类：

基因编辑

联系我们

产品描述

CRISPR 是多种古菌及细菌处理外来 DNA 侵袭的一种天然免疫系统，利用 Cas 蛋白酶进行切割，达到自身免疫的效果的工具。CRISPR-Cas 基因座由一系列编码 Cas 蛋白的基因和一个 CRISPR 重复间隔序列组成。典型的 CRISPR 重复间隔序列由一段前导序列、一系列短的高度保守的正向重复序列和间隔序列依序排列组成。2015 年 Makarova 实验室根据 RNA 与 Cas9 蛋白的分类提出了新的分类系统，把 CRISPR 系统细分为五种。

目前被最为广泛应用的 CRISPR 系统是CRISPR-Cas9 系统，在构建基因编辑动物中应用广泛，可直接对胚胎进行编辑。通过利用 CRISPR-Cas9 技术造成的 DSB 细胞的修复机制将不同的功能的结构域融合到 dCas9 核酸酶上，可以实现基因敲入和敲除、基因的抑制和激活，以及表观基因编辑等多个维度的生物学过程。CRISPR-Cas9 技术广泛应用于肿瘤研究、疾病模型、抗病育种、基因功能研究等方面。

在 CRISPR-Cas 基因编辑技术中，CRISPR-Cas9 基因座由反式激活 crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）基因、Cas 蛋白基因、CRISPR 序列组成。Cas编码的蛋白包括 Cas1-Cas10 具有核酸内切酶活性，Cas9 蛋白包括 HNH 与 RuvC 两个不同的结构域，HNH 结构域负责切割与crRNA互补配对的靶 DNA链，而 RuvC活性中心负责切割非互补链。

根据设计方案，将Cas9 mRNA、特异性sgRNA显微注射到 C57BL/6J 小鼠的受精卵中，移植入代孕鼠体内，生产出首建鼠（Founder，F0），构成全身敲除小鼠（Konck out，KO）。或将Cas9 mRNA、sgRNA与目的片段通过显微注射的方式，构成外源基因插入的首建鼠，后续进行测序、基因型鉴定等方式验证构建成功，交付客户。

基因编辑鼠包括：转基因（transgenic）、基因敲入(knock in)、基因敲除(knock out)和基因点突变(point mutation)鼠。繁育的鼠是杂合子（同一位点上的两个等位基因不相同的基因型个体）还是纯合子（同一位点上的两个等位基因相同的基因型个体）这就需要我们通过基因型鉴定来确定。常见的基因型鉴定方法包括直接PCR、RT-PCR和测序等。这里主要介绍最常用的直接PCR鉴定法。提取鼠的基因组DNA，通过PCR扩增DNA，利用DNA电泳根据条带大小和条带数量差异区分基因型。

实验分组包括：

WT Control：用野生型鼠组织或DNA作为对照，协助判断基因型及PCR体系是否合适。

Blank Control：不含有任何组织/DNA的对照组，用来质控PCR体系是否发生污染。

Internal Positive Control：内部对照，引物通常扩增与目的基因无关的基因组DNA区域，用来判断 PCR 体系和模板质量是否合适。

Sample：目标小鼠组织或DNA，鉴定基因编辑是否成功。

①鼠尾DNA提取：使用蛋白酶K对组织进行消化，快速释放基因组DNA。

②PCR扩增：配制特异性引物体系，加入DNA聚合酶，通过PCR反应扩增出目的DNA片段。

③琼脂糖凝胶电泳：PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带大小和位置判断野生型、杂合子和纯合子，点突变鼠只能通过测序的方法进行鉴定。

留言咨询